واكنش زنجیره‌های پلیمراز (‏PCR‏) روشی است برای تكثیر اختصاصی قطعات ‏DNA‏ كه نخستین بار در سال 1985 گزارش شد. در این روش قطعه‌ای از ‏DNA‏ به طور انتخابی با به‌كارگیری دو پرایمر اولیگونوكلوئوتیدی و آنزیم پلیمراز ‏Tag‏ می‌توان تا ده هزار برابر تكثیر كرد. هریك از این دو پرایمر به رشته‌های مخالفشان در روی ‏DNA‏ هدف متصل شده و مكان آنها به‌گونه‌ای است كه سنتز زنجیره ‏DNA‏ توسط آنزیم پلیمراز تنها در میان دو پرایمر انجام می‌گیرد.

 ‏
از آنجا كه زنجیره‌های تازه ساخته شده خود مكمل پرایمرها است، این چرخه می‌تواند پس از یك مرحله واسرشته شدن زنجیره‌های ‏DNA‏ از هم تكرار شود. به عبارتی ‏PCR‏ روشی است برای یك برنامه دوره‌ای مشتمل برای تكرار گرم و سرد كردن و ‏DNA‏ به‌كمك یك آنزیم ‏DNA‏ پلیمراز مقاوم به گرما و یك جفت پرایمر تحت تكثیر انتخابی قرار می‌گیرد و از طریق این روش ‏DNA‏ به صورت تصاعد هندسی زیاد می‌شود. امروزه روش ‏PCR‏ جایگاه بسیار مهمی را در جنبه‌های مختلف مهندسی ژنتیك، بیولوژی مولكولی، میكروب‌شناسی تشخیصی تشخیص سرطان و بیماری‌های ژنتیك، تشخیص هویت، جرم شناسی (پزشكی قانونی جهت تشخیص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعیین ترادف، باستان‌شناسی، مطالعات تكاملی موجودات و ... پیدا كرده است. كاربرد بیشتر و دقیق‌تر تكنیك ‏PCR‏ در تشخیص، روش‌های تغییر یافته‌ای از آن به وجود آمده است كه به تعدادی از آنها اشاره می‌شود.

مالتیپلكس پی سی آر (‏Multiplex-PCR‏)‏
‏ یكی از روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ است كه در آن تنها یك جایگاه ژنی مورد بررسی قرار می‌گیرد، با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تكثیر استفاده می‌شود. كاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ‏
‏1) بخش‌های بزرگی از یك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند بررسی شود. برای مثال كشف نقص‌ها در بیماری دیستروفی عضلانی روشن یا كشف بخش‌های مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مایكروباكتریوم توبر كلوزیس عامل بیماری سل، ‏
‏2) بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود و‏
‏3) می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به كار می‌رود كه انواع زیادی از جهش در آنها به وقوع می‌پیوندد.‏

آرتی-پی‌سی آر (‏RT-PCR‏)‏
‏ این روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداری معكوس نیز معروف است كه ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏DNAای كه مكمل توایس‌های ‏mRNA‏ است) توسط آنزیم نسخه‌بردار معكوس صورت می‌گیرد (‏RT‏). برخی از موجودات مانند برخی از ویروس‌های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضی از ویروس‌ها مانند ویروس هپاتیت ‏B‏ هرگز به شكل ‏DNA‏ مابین  در اثر آنزیم نسخه‌بردار معكوس درنمی‌آید. آنزیم نسخه‌بردار معكوس (‏RT‏) در این روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.
كاربرد این آنزیم به‌دلیل آن‌كه آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با كشف باكتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یك ‏DNA‏ پلیمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود یافت كه در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه‌برداری معكوس است و در دمای 72 درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیكول تترااستیك اسدی (‏EGTA‏) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای كه خود ساخته استفاده و آن را تكثیر می‌كند.‏

آرمز پی‌سی‌آر (‏ARMS-PCR‏)‏
‏ این روش تكثیری قدرتمند برای مشخص كردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

نستد پی‌سی‌آر (‏Nested-PCR‏)
در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری كه جفت دوم در بنی جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تكثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف كوچكتری از ‏DNA‏ كه درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تكثیر می‌شود.‏
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نیاز به پروب (كاوشگر) و تأییدهای بعدی كمتر است، 2) حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است و 3) به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت كننده‌ها رقیق می‌شود. این روش در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته‌اند بیماری‌های وابسته به جنس را تعیین كرده و از تولد كودكان بیمار جلوگیری كنند.‏
همچنین ویروس "سیتومگالوویدوس" كه می‌تواند سبب ناشنوایی در 1% از كودكان شود، توسط این روش تشخیص داده شده و امكان درمان زودهنگام از این طریق امكان‌پذیر است. جنین‌های مبتلا به سندروم داون نیز در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند.

 ‏Real-Time PCR
‏ به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایكلرها با سیستم فلورومتری كه اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از كاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده می‌شود. كه امكان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌های الكتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آكریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 كشف شد. این روش به دلیل كاهش زمان سیلك‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و كاربرد نشانگرهای فلوروژنیك و روش‌های حساس آشكارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و كاربران این روش سعی می‌كنند محصول ‏PCR‏ كوچك‌تر طراحی كنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌كند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیك اشاره كرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است. ‏

مراجع:‏
1. Guven.S,Yilmaz. E,kutby.H and eta. The Diagnostic Value of Polymerase chain Reaction (PCR) in Bronchialveolveolar Lavage. Eastern Journal of Medicine 9(1): 07-12, 2004
2. Maeda.S and etal. Helicobacter Pylori specific nested PCR assay for the detection of 23 S rRNA mutation associated with clarithomycin resistance. Gut.bmj.com.2007
3. Pusterla.N and etal. Real time polymerase chain Teaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for equine Infectious Disease. Journal vet International Medical; 20:3-12, 2006.
4. Salto‎-Telez M,etal. Multiplex RT-PCR for the Detection of Leukemia-Associated Translations. Journal of Molecular Diagnostic; 54):231-236, 2003.‎
5. Vakulenko.S.B and etal. Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Redsistance Gene in Enterococci. Animicrobal agents and chemotherapy;‎ 47(4)1423, 2003.
6. Hajbeigi.H and Radpour.R. Gentic Terminology Book. First edition. 424 Page 2002.

(Amplify :- Software for PCR - Ver.3.14 (for MacOSX

NetPrimer :- Primer design support tool

(Primer3: Software for designing PCR primers - MIT (USA

*دوست عزیز برای استفاده از برنامه ها روی هر کدام کلیک راست کرده و Open in new window را بزنید